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CORSO DI LAUREA TRIENNALE IN BIOTECNOLOGIE A.A. 2011-2012 GENETICA MOLECOLARE APPLICATA (BIO18 + MED03) (7+1 cfu) (Prof. Malaspina) PROGRAMMA DETTAGLIATO MAPPATURA GENETICA DEL GENOMA 1) Tipi di eredità mendeliana ed analisi dei pedigree. Eredità extranucleare (cenni). Analisi della variabilità genetica: calcolo delle frequenze alleliche per loci polimorfici autosomici e associati al cromosoma X, in condizione di dominanza o codominanza. Equilibrio di Hardy-Weinberg. Valutazione dell’equilibrio nelle popolazioni con il test del chi-quadrato. 2) Definizione di marcatore genetico ed analisi della segregazione alla meiosi; analisi dell’associazione tra loci per la costruzione di mappe genetiche; identificazione delle meiosi informative; clonaggio posizionale per geni responsabili di malattie; uso del lod score per la valutazione dell’associazione nell’uomo (cenni). Concetto di aplotipo. 3) Tipi di marcatori del DNA (RFLP, minisatelliti, microsatelliti, SNP), loro caratteristiche e relativi metodi per l’identificazione. 4) Tecniche per lo studio degli acidi nucleici. Ibridazione molecolare: principi e metodi; ibridazione di Southern blot, Northern blot, filtri con colonie batteriche. Marcatura di acidi nucleici e metodi di rilevazione: marcatura isotopica e non isotopica (con fluorofori). Marcatura interna e terminale. Ibridazione fluorescente in situ di cromosomi (FISH). La reazione a catena della polimerasi: principi ed applicazioni. Sequenziamento del DNA con il metodo di Sanger; sequenziamento automatizzato. MAPPATURA FISICA DEL GENOMA 1) Costruzioni di librerie genomiche e loro rappresentatività; librerie genomiche totali e librerie cromosoma-specifiche. 2) Caratteristiche principali dei vettori di clonaggio in procarioti (pBR322; pUC, M13, batteriofago lambda di sostituzione, cosmidi, BAC) ed eucarioti (cromosomi artificiali di lievito). 3) Metodi di identificazione dei cloni ricombinanti e loro assemblaggio in contigui (chromosome walking, fingerprinting del DNA ripetitivo, presenza di siti etichettati da una sequenza (STS). 4) Costruzione di librerie di cDNA. POST-GENOMICA 1) Metodi per l’identificazione di geni espressi: ricerca di ORF, sequenze promotore (vettori con geni reporter, sequenze geniche caratteristiche, utilizzo di banche dati); studio dell’espressione genica (librerie di cDNA, microarray; PCR quantitativa (RealTime PCR). 2) Produzione di proteine da geni clonati in procarioti: vettore di espressione pGEM, vettori con promotori inducibili; cassette e fusioni di geni; metodi di purificazione di proteine (cromatografia di affinità); 3) Produzione di proteine da geni clonati in eucarioti: vettori di espressione di lievito (YEp, Yip); 4) Studio delle interazioni proteina-proteina (phage display, sistema del doppio ibrido in lievito); 5) Produzione di proteine da geni clonati in cellule di mammifero: trasferimento genico mediante trasduzione virale. 6) Esempi di produzione proteine ricombinanti in cellule procariotiche ed eucariotiche; esempi di produzione di proteine in animali vivi (bioreattori). 7) Produzione di animali transgenici. Microiniezione nel pronucleo, trasferimento nucleare, trasfezione di cellule embrionali staminali. Trasferimento genico diretto o tramite vettori virali (retrovirus, adenovirus, virus adeno-associati). Inserzione genica ectopica o mirata. TERAPIA GENICA: Applicazioni a malattie con perdita o acquisto di funzione; Terapia genica somatica (ex vivo e in vivo); terapia genica germinale. Esempi di terapia genica nell’uomo. Testi consigliati: 1)Griffith et al.''Genetica, principi di analisi formale'' Ed. Zanichelli. 2) Brown TA ''Biotecnologie molecolari: principi e tecniche'' Ed. Zanichelli
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